本文標題:"腐敗產(chǎn)品之特性分析與微生物分離鑑定"
發(fā)布者:yiyi ------ 分類(lèi): 技術(shù)文章 ------
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ㄧ. 腐敗產(chǎn)品之特性分析與微生物分離鑑定
來(lái)源:腐敗產(chǎn)品之鋁箔包保久乳來(lái)自A廠(chǎng),調味乳來(lái)自B廠(chǎng)。
腐敗包內容物直接鏡檢
腐敗包經(jīng)搖動(dòng)混合后,以75% 酒精擦拭包裝盒頂,在無(wú)菌操作箱中以U. V. 照射表面,按鄭等(1997)之方法,將異常品取內容物1 ml,在5 ml無(wú)菌水中稀釋?zhuān)谖幌嗖?a target="_blank">顯微鏡(OPTIPHOT-2, Nikon)觀(guān)察腐敗菌之形態(tài),并記錄腐敗產(chǎn)品之特性,如pH值、口味。
腐敗產(chǎn)品之取樣培養與微生物分離
以無(wú)菌操作法使用無(wú)菌吸管吸取0. 2 ml之內容物至nutrient agar(Difco)表面涂抹,在35 ℃培養三天,由nutrient agar之平板上挑出五個(gè)菌落,于位相差顯微鏡下觀(guān)察是否與直接鏡檢腐敗內容物具有相同細胞形態(tài)與菌相。若具運動(dòng)性,革蘭氏陽(yáng)性,并產(chǎn)生孢子,符合這些條件之菌落,再以API(Analytab Products Inc. )公司之API 50CHB和API 20E快速檢測套組(Logan and Berkeley, 1984),在35 ℃,48小時(shí)培養后,觀(guān)察呈色反應,將結果輸入ATB(Automatic Tests in Bacteriology)自動(dòng)判讀系統,鑑定其種名。
二. 孢子懸浮液之制備
一般處理:由腐敗保久乳分離鑑定后之菌株B. cereus TP-5以nutrient broth培養隔夜,取0.1 ml涂抹于含10 ppm MnCl2?4H2O之nutrient agar的平板內(Kim and Naylor, 1966),于35 ℃ 培養4天,在位相差顯微鏡下觀(guān)察,孢子完全成熟后再加入無(wú)菌水將培養基表面的孢子用涂抹棒將其刮起放入試管中,再用無(wú)菌水清洗三次(8000X,離心10分鐘),做成孢子懸浮液,然后于85 ℃ 熱水中加熱12分鐘,以殺死營(yíng)養細胞,并于4 ℃ 冷藏之(Rajkowski and Mikolajcik, 1987)。
特殊處理:按Gaze et al.(1990)增加細菌孢子之耐熱性之方法,將分離株B. cereus TP-5涂抹于產(chǎn)孢之培養基(7.5 g之nutrient agar,含10 ppm MnCl2?4H2O, 0.8 ml之100 ppm(w/v)之CaCl2 和2.2 M sucrose,溶于300 ml蒸餾水),40 ℃ 培養5天,在位相差顯微鏡下觀(guān)察,孢子完全成熟后,用2.2 M sucrose溶液收集,做成孢子懸浮液,然后于85 ℃ 熱水中加熱12分鐘,迅速冷卻后,儲存于4 ℃ 備用。
三. 孢子耐性測試
按Russell(1982)之方法將前項已收集好的孢子以0. 067 M磷酸緩衝溶液(phosphate buffer solution)稀釋?zhuān)姑縨l約含106個(gè)孢子,各裝2 ml孢子懸浮液于TDT試管(thermal death time tube),并以火焰封管后,置于恒溫油槽中(NESLab, Exacal, EX-251 HT, USA),同一個(gè)溫度五種不同的加熱時(shí)間,各取6支試管測試其100 ℃、105 ℃ 和110 ℃ 之孢子耐熱性,加熱完畢后立即放入冰浴槽中冷卻,再以鉆石玻璃刀將TDT試管開(kāi)口打破,孢子懸浮液倒入殺菌過(guò)的nutrient broth,并按Ashton(1971)之方法添加0.1% soluble starch(Difco)以增加受傷孢子之回收,在35 ℃ 培養二天,觀(guān)察試管中微生物有無(wú)生長(cháng)。D值計算根據Stumbo ( 1973a ) 之方法如下:
D= t /(log a-log b)
t:加熱時(shí)間
a:最初細菌孢子數
b:殘存細菌孢子數
6支試管全部生長(cháng)時(shí),則視為每支試管至少有一個(gè)以上孢子未被殺死;只有部份生長(cháng),部份未生長(cháng)時(shí),視為有生長(cháng)的為各由一個(gè)殘存孢子生長(cháng)所致,D值為殺菌孢子數90% 所需之時(shí)間,Z值為細菌孢子之D值降低90% 時(shí)所需溫度之差距,亦即細菌孢子死滅速度D值之溫度系數。
四. UHT對于B. cereus 孢子之殺菌效果
將B. cereus TP-5之孢子懸浮液接種至還原乳300 L,使每ml之還原乳中含105~106個(gè)之孢子,經(jīng)由板式熱交換機(Sterilab, Vtis, Alfa Laval, Sweden)之加熱135 ℃ 或140 ℃,4秒后,以TBA 3充填機(Tetra Pak, Sweden)包裝后產(chǎn)品經(jīng)37 ℃ 保溫14天后,檢測其包裝外觀(guān)和內容物所產(chǎn)生之腐敗現象。
五. CIP清洗與蒸汽預殺菌對于B. cereus孢子之殺菌
將B. cereus TP-5之孢子懸浮液加入300 L之還原乳,使還原乳之孢子數105 spores/ml,于板式熱交換、無(wú)菌管路和無(wú)菌桶中循環(huán)1小時(shí)后再以CIP清洗,以熱水、堿液、熱水、酸液、熱水之順序清洗,先以熱水沖洗5分鐘,再以1.5% NaOH堿液,80 ℃ 清洗30分鐘,熱水沖洗后再以1% HNO3,65 ℃ 清洗25分鐘,最后以50 ℃ 熱水沖洗;隔天生產(chǎn)前,再使用蒸汽殺菌管路,蒸汽維持在121℃,30分鐘。蒸汽殺菌后,將無(wú)菌桶之閥組與板式熱交換機之板片拆卸,以棉花棒涂抹法,按Sveum et al. ( 1992 ) 之方法取板片上有乳垢之處,依CNS 12540仙人掌桿菌之MPN檢測法檢測,正反應之試管按Holbrook and Anderson(1980)之方法,涂抹至PEMBA(polymyxin pyruvate egg yolk mannitol bromothymol blue agar)(bactopeptone, 0.1%; D-mannitol 1%; MgSO4.7H2O 0.01%; NaCl 0.2%; Na2HPO4 0.25%; KH2PO4 0. 025%; bromothymol blue 0. 012%; agar 1.5 %; pH 7. 2±0. 2)。polymyxin最終濃度為100 unit/ml,培養在35 ℃,48小時(shí),典型菌落為圓鋸齒狀,綠色菌落之透明外環(huán)。由PEMBA之每個(gè)平板上挑出三個(gè)典型菌落,并在位相差顯微鏡下觀(guān)察是否是產(chǎn)孢桿菌,具運動(dòng)性,并且好氣和厭氣下都能生長(cháng),符合這些條件的菌落,再以API 50CHB和API 20E快速檢測套組,在35 ℃,48小時(shí)培養后觀(guān)察呈色反應,將結果輸入ATB自動(dòng)判讀系統,鑑定種名,以確定其是否為B. cereus。
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